Agent spécial Leroy Jethro Gibbs : C'est le chef de l'équipe du NCIS. Ancien marine, divorcé de trois femmes rousses, il a perdu sa femme et sa fille dans une attaque. Un des mystères entourant Gibbs est cette femme rousse qui vient le chercher très souvent. Homme très professionnel, il n'hésite pas à frapper le dos de la tête de DiNozzo et (mais moins souvent) de McGee, et même, quelquefois, de Ziva, alors qu'il n'avait jamais osé taper derrière le crâne de Kate. Il est le modèle de DiNozzo et McGee. Bien qu'il ne l'avoue pas vraiment, Gibbs éprouve une sorte d'affection particulière envers McGee, même si cette affection n'est pas comparable à celle qu'il éprouve pour Abby ou à l'amitié qui le lie de longue date à Ducky.
Agent spécial Antony « Tony » DiNozzo : C'est l'un des assistants de Gibbs, il est passionné de cinéma. Il est très gamin et fait souvent des coups fourrés à Kate et humilie McGee aussi souvent qu'il le peut. Mais après ce qui est arrivé à Kate, il change radicalement même s'il ne veut pas l'admettre. Gibbs a confiance en Tony et n'hésite à le laisser gérer la situation quand sa vie en dépend (bête noire). Tout comme son acteur Michael Weatherly, Tony DiNozzo est fou de séries télé, et plus particulièrement de Magnum, dont il connaît tous les épisodes par coeur.
Agent spécial Caitlin « Kate » Todd : Ancien agent des services secrets, ayant notamment assuré la protection du président des États-Unis d'Amérique, elle collabore dans le premier épisode avec le NCIS sur un meurtre à bord d'Air Force One. Elle démissionne de ce service pour avoir couché avec un militaire et pour ne pas avoir suivi les ordres de ses supérieurs. Elle a un faible pour Ari. Dans ses années au collège elle participe à un concours de T-shirt mouillé que Tony découvre et qu'il utilise par la suite pour la faire chanter. Elle entretient une relation amicale compliquée avec Tony, une relation professionnelle ambiguë avec Gibbs et une relation amicale avec Abby puisque celles-ci partent souvent en vacances ensemble.
Abigail « Abby » Sciuto : C'est la scientifique de l'équipe. C'est une extravertie au look extrême gothique, voir punk, elle dort dans un cercueil, a toujours des couettes, ou des macarons, et du rouge à lèvres rouge ou noir, elle se promène toujours avec son « caf-pow ». Elle a une relation avec McGee. Elle a plusieurs tatouages : une toile d'araignée au cou, des triangles sur le poignet, le symbole de l'infini, une grande croix gothique dans le dos, et d'autre non divulgués. Abby et Gibbs s'entendent très bien, comme un père et sa fille, ils parlent le langage des signes ensemble car les parents d'Abby sont sourds. Elle s'entendait aussi très bien avec Kate, qui est morte, et d'une façon générale avec le reste de l'équipe.
Agent spécial Timothy « Tim » McGee : Ancien étudiant à Norfolk, diplômé du MIT, il est expert en informatique. Peu confiant en lui, il est surnommé « le bleu » par Tony, plus rarement par Abby lorsqu'elle est énervée par sa naïveté. Cependant, il n'est pas véritablement peureux ni même incompétent, bien au contraire. De stagiaire en informatique à ses débuts, il passe agent du terrain à plein temps lors de la deuxième saison. Il a l'occasion vers la fin de celle-ci (épisode Enchaînés) de faire preuve de courage face à la hiérarchie en déclarant « Allez vous faire voir » à la Secrétaire d'état, sur un conseil de Gibbs. Après la mort de Kate, son caractère s'affirme et il devient même de plus en plus indispensable.
Docteur Donald « Ducky » Mallard : Il a étudié en Écosse dans le but de devenir médecin légiste. Son intervention est bien souvent indispensable pour lancer le début d'une enquête. Il est très bavard et parle souvent à ses patients qui sont évidemment morts, et sa très large culture générale alimente ses monologues. Il partage également son vécu, même si ce point embête parfois ses collègues. Il parle également très bien le français, comme le prouve son dialogue avec le trafiquant d'arme "La Grenouille" dans la 4e saison.
Il connaît bien Gibbs, sûrement plus que tous les autres membres de l'équipe, car leur rencontre date de peu de temps après l'entrée de Gibbs au NCIS. Il est ainsi un des seuls à l'appeler par son prénom, "Jethro". Apprécié, mais pas ménagé par les autres membres de l'équipe, le travailleur de l'ombre « Ducky » connaît aussi ses épisodes de gloire. Il vit avec sa mère (qui a presque 100 ans), probablement victime de la maladie d'Alzheimer (« une forme de démence », dit Ducky). Ce personnage apparaît dans quelques épisodes, devenant un sujet de préoccupation du médecin. Non pas à cause de sa santé, mais des ennuis qu'elle peut parfois causer. Parmi ses faits d'armes, elle s'éprend brièvement d'un « beau jeune homme », Gibbs. Elle s'imagine que Ducky et Abby sont mari et femme et considère DiNozzo (chargé de la protéger dans Vengeance d'outre-tombe) comme un gigolo, séduite par son nom italien, aussi bien que comme un malfrat. Un des clins d'½il de la série est à propos de la carrière de David McCallum. Lorsqu'Abby demande à Gibbs à quoi ressemblait Ducky plus jeune, celui-ci répond « À Ilya Kuryakin ». Ce personnage de la série télévisée très connue Des Agents très spéciaux a été joué par David McCallum, dans les années 60.
Officier Ziva David : Ziva David est un agent de liaison du Mossad rattachée au bureau du NCIS de Washington au début de l'épisode 3x04 (Trésor de guerre). Elle est spécialiste des interrogatoires sous forme de torture et peut se montrer dissuasive. C'est un agent très bien entraîné et qui utilise le lancer de couteau. Elle adore taquiner Tony et est très colérique. Elle est la demi-s½ur de Ari Haswari (le tueur de Kate). Elle s'entend très bien avec McGee à ses débuts au NCIS (ce qui avait pour don d'agacer DiNozzo), elle le prendra pourtant en grippe en croyant se reconnaître sous un mauvais jour dans un roman, pourtant totalement fictif, que McGee a écrit.
Jennifer « Jenny » Shepard : directrice du NCIS à partir de 2005, est une ancienne équipière de Gibbs avec lequel elle entretenait une aventure. Leurs rapports professionnels sont souvent « inversés » : il n'est pas rare que Gibbs la conseille de manière un peu directe.
De plus, Shepard est assez complice avec Ziva David, à qui elle a fait intégrer l'équipe.
Lors de l'enlèvement de Shepard par le frère d'un détenu du NCIS, son chauffeur sera abattu.
